神外前沿讯，近日，复旦大学附属华山医院神经外科胶质瘤团队在美国肿瘤免疫治疗学会（SITC）会刊《Journal for ImmunoTherapy of Cancer》（最新影响因子9.913）上，发表题为“Enhanced B7-H4 expression in gliomas with low PD-L1 expression identifies super-cold tumors”的研究，在国际上首次发现胶质瘤免疫微环境中B7-H4和PD-L1免疫检查点分子呈现互斥表达规律，并提出“超冷”胶质瘤免疫新分型。

本研究在华山医院周良辅院士（专访链接）和毛颖教授（专访链接）指导下、胶质瘤团队吴劲松教授（专访链接）、秦智勇教授（专访链接）和张义教授帮助下开展，通讯作者为华山医院姚瑜教授（演讲链接），共同通讯作者为深圳大学脑病与大数据研究所张焱教授，第一作者为华山医院神经外科陈弟博士，共同第一作者为深圳大学李高鹏和华山医院纪春霞。

原文链接：https://jitc.bmj.com/content/8/1/e000154

据了解，相比黑色素瘤等颅外肿瘤而言，脑胶质瘤属于典型的“冷”肿瘤，主要特征之一是微环境中缺乏浸润性T淋巴细胞（Tumor-infiltrating lymphocytes，TIL）。因此，最引人注目的PD-1/PD-L1抗体在胶质瘤上的治疗效果表现微弱，仅小部分群体可产生治疗反应。免疫检查点抑制剂仍旧是肿瘤免疫治疗的重点研究对象，故深入分析免疫检查点分子在胶质瘤中的表达模式，是制定个性化免疫治疗策略的重要步骤。

华山医院神经外科团队前期历经8年研究，深入阐明了免疫负性分子B7-H4在胶质瘤中的免疫作用及其转录调控机制。而且该团队在一项历时6年完成的DC疫苗治疗脑胶质瘤临床试验中也证实了B7-H4与免疫治疗效果密切相关。

本研究共纳入505例胶质瘤患者组织样本（WHO II级145例，WHO III级126例，WHO IV级234例），进行B7-H4和PD-L1组化染色和评分，结果发现：在蛋白质水平，同时高表达B7-H4和PD-L1蛋白的胶质瘤亚群仅占2%，表明了两类免疫检查点分子存在互斥表达规律。

图1 B7-H4和PD-L1在蛋白质水平上的表达模式

随后，该研究继续对CGGA和TCGA两个RNA测序数据库中B7-H4和PD-L1表达水平进行相关性分析，也得到了同种规律：在mRNA水平，B7-H4和PD-L1的表达水平呈现负相关性。有趣的是，除B7-H4以外，PD-L1与其余常见的免疫负性分子（CTLA-4,TIM-3等）均表现为共表达关系。
 

图2 B7-H4和PD-L1表达水平(mRNA)的相关性分析:a.TCGA;b.CGGA

为了进一步分析B7-H4和PD-L1相关通路在胶质瘤免疫微环境形成过程中扮演的角色，该研究利用相关性分析在TCGA中筛选确定了两个共表达基因模块：B7-H4共表达基因模块（35个基因）和PD-L1共表达基因模块（62个基因）；以两个基因模块为建模对象，采用非负矩阵分解法对TCGA胶质瘤样本进行聚类，发现：每个级别的胶质瘤都可被清晰得划分为三个亚型，并且缺少同时高度富集两类共表达基因模块的胶质瘤亚型。以相同的基因模块对CGGA胶质瘤样本进行聚类时也得到了同样的分群现象。
 

图3 B7-H4和PD-L1共表达基因模块的聚类分析:a.TCGA数据库的四级胶质瘤;b.CGGA数据库的四级胶质瘤

后续利用多种算法分别对CGGA和TCGA组织样本中免疫细胞浸润水平进行分析，结合聚类亚型组间比较发现：高富集B7-H4共表达基因模块的胶质瘤亚型中免疫细胞浸润很少，包括TIL，且该现象与肿瘤级别无关。对505例组织样本进行CD3指标染色后进行分组比较也得到类似结果。以上结果表明：B7-H4及相关通路高度富集的胶质瘤亚型属于一种“超冷”免疫亚型，免疫微环境中极度缺乏T淋巴细胞的浸润。

图4 免疫亚型间免疫细胞浸润水平的比较:a.整体免疫细胞浸润水平;b.肿瘤纯度;c.各类免疫细胞的浸润程度

本研究以三个大样本胶质瘤数据库相互印证，同时从蛋白质和mRNA水平阐述了两个重要的免疫检查点分子在免疫微环境中的表达模式。研究结果揭示：

（1）首次提出一种全新的“超冷”胶质瘤免疫分型，这种新分型得到的胶质瘤亚群在免疫微环境特征上完全不同，或可成为免疫治疗效果评估的标记物，同时也提示“超冷”免疫亚型的胶质瘤患者可能需要一种全新的治疗方式；

（2）发现B7-H4及相关通路与“冷”性免疫微环境相关，深入研究B7-H4在诱导“冷”肿瘤形成中的具体机制可为将来“逆冷为热”免疫治疗策略的开发提供思路。

本研究受国自然重大研究计划、国自然面上和上海市抗癌协会青年医师“雏鹰”项目等的资助。

论文通讯作者

姚瑜，医学博士、主任医师、复旦大学博士生导师，师从于周良辅院士。现任华山医院神经外科脑胶质瘤外科中心副组长、复旦大学神经外科研究所免疫室主任、中国医师协会脑胶质瘤专业委员会学组副主委、上海医学会神经外科分会基础研究和转化医学学组副组长、上海市抗癌协会青年理事会副理事长、美国癌症登月计划（GBM AGILE）国际成员、中国中枢神经系统胶质瘤免疫和靶向治疗共识制定专家组组长、中国神经系统肿瘤免疫和靶向治疗论坛执行主席。王忠诚中国神经外科医师奖、第一届中国肿瘤青年科学家奖、中国抗癌协会科技奖等获得者。先后承担国自然重大研究计划、国自然面上项目、上海市科委国际政府间合作项目等国家和省部级科研项目十余项。以第一作者/通讯作者身份共发表国内外论文60余篇，其中SCI论文40余篇。

论文共同通讯作者

张焱，博士，深圳大学生命与海洋科学学院特聘教授，深圳大学脑病与大数据研究所所长，深圳大学神经系统疾病临床医学研究中心副主任。本科毕业于浙江大学医学院临床医学系，博士毕业于中国医学科学院&北京协和医学院生物医学工程系。曾在美国哈佛医学院担任讲师和副遗传学家。2011年至2016年任中科院上海生命科学研究院研究员，2012年入选中科院“百人计划”，2015年获深圳市“鹏城学者”特聘教授。先后承担十余项国家自然科学基金、中科院和省部级项目。已在国外学术刊物上发表SCI论文70余篇，总影响因子在400分以上。

论文第一作者

陈弟，复旦大学附属华山医院神经外科博士生，导师周良辅院士，主要研究方向为脑肿瘤免疫治疗的临床及其转化基础研究。以（共同）第一作者身份共发表SCI论文6篇（累计IF＞25），获上海市抗癌协会青年医师“雏鹰”项目（A类）、世界神经外科联盟（WFNS）Grant Winner (30 best oral presentations)、第十届中国青少年科技创新奖、全国优秀共青团员等荣誉。